Митохондрия геномы. О митохондриальной еве и генетическом разнообразии современного человечества. Расшифровка генома животных

Функционирование митохондриального генома

Что же особенного в механизмах репликации и транскрипции ДНК митохондрий млекопитающих?

У большинства животных комплементарные цепи в мтДНК значительно различаются по удельной плотности, поскольку содержат неодинаковое количе-ство “тяжелых” пуриновых и “легких” пиримидиновых нуклеотидов. Так они и называются - H (heavy - тяжелая) и L (light - легкая) цепь. В начале репли-кации молекулы мтДНК образуется так называемая D-петля (от англ. Displace-ment loop - петля смещения). Эта структура, видимая в электронный микро-скоп, состоит из двуцепочечного и одноцепочечного (отодвинутой части Н-цепи) участков. Двуцепочечный участок формируется частью L-цепи и компле-ментарным ей вновь синтезированным фрагментом ДНК длиной 450-650 (в зависимости от вида организма) нуклеотидов, имеющим на 5"-конце рибонук-леотидную затравку, которая соответствует точке начала синтеза Н-цепи (oriH). Синтез L-цепи начинается лишь тогда, когда дочерняя Н-цепь доходит до точки ori L. Это обусловлено тем, что область инициации репликации L-цепи доступ-на для ферментов синтеза ДНК лишь в одноцепочечном состоянии, а следовате-льно, только в расплетенной двойной спирали при синтезе Н-цепи. Таким обра-зом, дочерние цепи мтДНК синтезируются непрерывно и асинхронно (рис.3).

Рис 3.

В митохондриях общее число молекул с D-петлей значительно превыша-ет число полностью реплицирующихся молекул. Обусловлено это тем, что у D-петли есть дополнительные функции - прикрепление мтДНК к внутренней ме-мбране и инициация транскрипции, поскольку в этом районе локализованы промоторы транскрипции обеих цепей ДНК. В отличие от большинства эв-кариотических генов, которые транскрибируются независимо друг от друга, ка-ждая из цепей мтДНК млекопитающих переписывается с образованием одной молекулы РНК, начинающейся в районе ori H. Помимо этих двух длинных мо-лекул РНК, комплементарных Н- и L-цепям, формируются и более короткие участки Н-цепи, которые начинаются в той же точке и заканчиваются на 3"-кон-це гена 16S рРНК (рис.4). Таких коротких транскриптов в 10 раз больше, чем длинных. В результате созревания (процессинга) из них образуются 12S рРНК и 16S рРНК, участвующие в формировании митохондриальных рибосом, а так-же фенилаланиновая и валиновая тРНК. Из длинных транскриптов вырезаются остальные тРНК и образуются транслируемые мРНК, к 3"-концам которых при-соединяются полиадениловые последовательности. 5"-концы этих мРНК не кэ-пируются, что необычно для эвкариот. Сплайсинга (сращивания) не происхо-дит, поскольку ни один из митохондриальных генов млекопитающих не содер-жит интронов.

ND1-ND6, ND4L - гены субъединиц НAД-H-дегидрогеназного комплекса; СОI-COIII - гены субъединиц цитохром-с-оксидазы; ATP6, ATP8 - гены субъединиц AТФ-синтетазы Cyt b - ген цитохрома b.

Рис 4. Транскрипция мтДНК человека, содержащей 37 генов. Все транскрипты начинают синтезироваться в районе ori H. Рибосомные РНК вырезаются из длинного и короткого транскриптов Н-цепи. тРНК и мРНК образуются в результате процессинга из транскриптов обеих цепей ДНК. Гены тРНК обозначены светло-зеленым цветом.

Хотите узнать какие еще сюрпризы способен преподнести митохон-дриальный геном? Отлично! Читаем дальше!..

Несмотря на то, что в геномах митохондрий млекопитающих и дрожжей содержится приблизительно одинаковое количество генов, размеры дрожжево-го генома в 4-5 раз больше - около 80 тыс. пар нуклеотидов. Хотя кодирую-щие последовательности мтДНК дрожжей высоко гомологичны соответствую-щим последовательностям у человека, дрожжевые мРНК дополнительно имеют 5"-лидерную и 3"-некодирующую области, как и большинство ядерных мРНК. Ряд генов содержит еще и интроны. Так, в гене box, кодирующем цитохром-оксидазу b, имеется два интрона. Из первичного РНК-транскрипта автокатали-тически (без участия каких-либо белков) вырезается копия большей части пер-вого интрона. Оставшаяся РНК служит матрицей для образования фермента ма-туразы, участвующей в сплайсинге. Часть ее аминокислотной последовательно-сти закодирована в оставшихся копиях интронов. Матураза вырезает их, разру-шая свою собственную мРНК, копии экзонов сшиваются, и образуется мРНК для цитохромоксидазы b (рис.5). Открытие такого феномена заставило пере-смотреть представление об интронах, как о “ничего не кодирующих последова-тельностях”.

Рис 5.

При изучении экспрессии митохон-дриальных генов Trypanosoma brucei обнаружилось удивительное отклонение от одной из основных аксиом молекулярной биологии, гласящей, что после-довательность нуклеотидов в мРНК в точности соответствует таковой в коди-рующих участках ДНК. Оказалось, мРНК одной из субъединиц цитохром-с-оксидазы редактируется, т.е. после транскрипции изменяется ее первичная структура - вставляется четыре урацила. В результате образуется новая мРНК, служащая матрицей для синтеза дополнительной субъединицы фермента, пос-ледовательность аминокислот в которой не имеет ничего общего с последова-тельностью, кодируемой нередактированной мРНК (см. таблицу).

Наибольший сюрприз ученым митохондрии преподнесли в 1979 г. До то-го времени считалось, что генетический код универсален и одни и те же трип-леты кодируют одинаковые аминокислоты у бактерий, вирусов, грибов, расте-ний и животных. Английский исследователь Беррел сопоставил структуру од-ного из митохондриальных генов теленка с последовательностью аминокислот в кодируемой этим геном субъединице цитохромоксидазы. Оказалось, что гене-тический код митохондрий крупного рогатого скота (как и человека) не просто отличается от универсального, он “идеален”, т.е. подчиняется следующему пра-вилу: “если два кодона имеют два одинаковых нуклеотида, а третьи нуклеоти-ды принадлежат к одному классу (пуриновых - А, Г, или пиримидиновых - У, Ц), то они кодируют одну и ту же аминокислоту”. В универсальном коде есть два исключения из этого правила: триплет АУА кодирует изолейцин, а кодон АУГ - метионин, в то время как в идеальном коде митохондрий оба эти трип-лета кодируют метионин; триплет УГГ кодирует лишь триптофан, а триплет УГА - стоп-кодон. В универсальном коде оба отклонения касаются прин-ципиальных моментов синтеза белка: кодон АУГ - инициирующий, а стоп-кодон УГА останавливает синтез полипептида. Идеальный код присущ не всем описанным митохондриям, но ни у одной из них нет универсального кода. Мож-но сказать, что митохондрии говорят на разных языках, но никогда - на языке ядра.

Различия между “универсальным” генетическим кодом и двумя митохондриальными кодами

Митохондриальный

код млекопитающих

Митохондриальный

код дрожжей

“Универсальный”

Presentation Transcript

Синдром Лебера: LHON (1871 г.) наследуемая по материнской линии потеря зрения происходит у людей 20-30 лет вследствие атрофии зрительного нерва и дегенерации ганглиозного слоя клеток ретины Заболевание связано с передаваемой от матери мутацией митохондриальной ДНК в одном из ND генов (комплекс I). В 70% случаев это G11778A(ND4), а в Японии в 90% в 13% случаев G3460A (ND1); в 14% случаевT14484C (ND6) Мутация находится в гомоплазматическом состоянии

634 п.н. ДНК-диагностика синдрома Лебера в семье Nпроведена нами впервые в 2006 году G11778 G11778A замена пробанд с синдромом Лебера здоровый сестра мать человек пробанда

В 80-85% случаев поражаются мужчины (Х хромосома несет какой-то локус чувствительности?) Лишь у 50% мужчин и 10% женщин носителей патогенных мутаций комплекса I в действительности происходит потеря зрения?? Чаще всего мутации, ведущие к синдрому Лебера, встречаются в мтДНК гаплогруппы J; эту группу несут около 15% европейцев?? В формировании заболевания участвуют какие-то дополнительные факторы (???)

Самая часто встречающаяся точечная мутация: А3243Gв лейциновой тРНК Обнаружена у большинства больных с синдромом MELAS инсультоподобные(stroke-like) эпизоды Миопатия лактат-ацидоз энцефалопатия Мутация встречается исключительно в гетероплазматическом состоянии В одних семьях А3243Gвызывает преимущественно кардиомиопатию, в других – диабет и глухоту, в третьих PEO, в четвертых - энцефалопатию???

Синдрома MELAS была проведена нами в 2007 году Мама: фенотипически здоровая женщина очень маленького роста I брак II брак 2ой ребенок 1991-2007 Менингоэнцефалит Умерот ишемического инфаркта обоих полушарий мозжечка 3ий ребенок родился в 1998 Прогрессирующая миопатия, миокардио-дистрофия 1ый ребенок 1988-2000 Кардиопатия, ЗПР, ЗФР. Умерла скоропостижно после травмы Митохондриопатия?? Обнаружена мутация MELAS у сына (80% мутантных молекул в крови) у мамы(40%)

РНК(продолжение) Мутация А8344Gв гене лизиновой тРНК при уровне мутантных молекул > 85% приводит к синдрому MERRF: Миоклонус-эпилепсия; «рваные» красные мышечные волокна; задержка умственного развития; атаксия; атрофия мышц и др. Матери больных обычно фенотипически здоровы или несут слабо выраженные симптомы Мутация резко снижает эффективность трансляции в мт и тем самым провоцирует дефицит дыхательной цепи

Чаще всего встречается мутация гена 12S рРНК A1555G Вызывает несиндромную потерю слуха из-за чувствительности носителей мутации к ототоксическим аминогликозидам Другие мутации генов 12S и 16S вызывают кардиомиопатию, атаксию, MELAS, диабет mellitus, сенсорно-невральная потерю слуха

NARP (neuropathy ataxia and retinitis pigmentosa) Мутация в генеATPase6– трансверсияТ – G в нуклеотиде 8993 (70-90% мутантной ДНК) T8993G:лейцин замещаетсянааргинин вATPase6, чтоприводит к нарушению синтеза АТФ Если доля мтДНК больше 90%, клиническое проявление наблюдается раньшеи симптомы более тяжелые:подострая некротизирующая энцефалопатия с чертами синдрома Лея (LS)

Нейродегенеративное заболевание: - симметричные некротические повреждения в субкортикальных областях ЦНС – базальных ганглиях, таламусе, стволе мозга, спинном мозге; - демиелинизация, сосудистая пролиферация и «глиозис»; - моторная и умственная регрессия, атаксия, дистония, аномальное дыхание Заболевание начинается в раннем детстве, редко во взрослом состоянии; Смерть наступает обычно через два года после начала заболевания

ДНК (MILS) 7/10 cлучаев – рецессивные мутации ядерных аутосомных генов, кодирующих субъединицы дыхательной цепи или белки, участвующие в ее сборке ATPase 6 LS 1/10 cлучаев – мутации Х-хромосомы PDHC

Причина – крупная делеция 5 т.п.н. Утрачиваются 5 генов тРНК и 5 белковых генов KSS –фатальная мультисистемная патология, проявляется в возрасте 4-18 лет:CPEO, пигментный ретинит, атаксия,глухота, эндокринная дисфункция, атриовентрикулярная блокада сердца, повышение уровня белка в цереброспинальной жидкости выше 100 мг/дл, «рваные» волокна в скелетных мышцах Делеция не наследуется

2 синдрома: Синдром Пирсона –PS Гипопластическая анемия, нарушение экзокринной функции поджелудочной железы Синдром PEO– Прогрессирующая наружная офтальмоплегия Все три синдрома являются спорадическими, формиуются в зависимости от сегрегации мутантных мтДНК с накоплением в разных тканях

П.н. вместо фатального KSS может наблюдаться PEO Прогрессирующая наружная офтальмоплегия, птоз Патология связана с параличом наружных глазодвигательных мышц Процент мутантных молекул в этом случае меньше, чем при KSS синдроме, синдром не связан с угрозой для жизни больного Биохимически в мышцах обнаруживаются дефекты ферментов дыхательной цепи, особенно цитохромоксидазы

Деплеции -МDS В клетках остается 1 - 30% от нормального количества мтДНК Синдром проявляется в первые недели после рождения: фатальная гепатопатия; миопатия с генерализованной гипотонией; кардиомиопатия с судорогами (синдр. де-Тони-Дебре-Фанкони); атрофия проксимальных групп мышц; утрата сухожильных рефлексов. Смерть наступает в тяжелых случаях в первый год жизни

Генов дыхательной цепи LHON LHON+дистония Спорадическая миопатия Спорадическая миопатия Энцефаломиопатия Спорадическаямиопатия NARP MILS FBSN М Я Синдром Лея Лейкодистрофия Синдром Лея Кардиоэнцефалопатия Лейкодистрофия/тубулопатия Синдром Лея Параганглиома

Митохондриальную аномалию? При ясных симптомах – выделить кровь из вены и сделать ПЦР-анализ на точечные мутации или делеции Если результат анализа крови отрицательный, это еще не значит отсутствия заболевания (гетероплазмия!) Нужно взять биопсию: мышечную или кожную пробу у взрослых у детей Для неинвазивного тестирования используют седимент мочи, соскоб внутренней поверхности щеки, реже волосяные фолликулы

Митохондриальную аномалию? (2) Свежую мышцу анализируют гистологически и гистохимически Проводятся измерения активности отдельных звеньев комплексов дыхательной цепи «Рваные» мышечные волокна выявляются при окраске на сукцинатдегидрогеназную активность или с помощью Гомори “trichrome stain” культура фибробластов свежая мышца Если обнаруживается дефект в одном звене, это указывает на мутацию соответствующей субъединицы (я или м), если дефекты множественные – возможен дефект мт тРНК либо ядерных генов, участвующих в работе митохондрий

Митохондриальную аномалию? (3) Иногда дефект проявляется при нагрузке (NARP синдром при мутации гена ATPase6) –нужно клиническое тестирование: физические нагрузки с замерами лактата, магнитно-резонансной или инфракрасной спектроскопией Наконец, в случае еще не описанных, редких «private» мутаций проводят прямое секвенирование мтДНК

Заболеваний вовлеченность разных органов и одновременное проявление внешне не связанных между собой аномалий Наружная офтальмоплегия с нарушением проводимости сердечной мышцы и мозжечковой атаксией Мигрени с мышечной слабостью Энцефало- миопатия с диабетом Тошнота, рвота с оптической атрофией и кардиомиопатией Диабет с глухотой Глухота с наружной офтальмоплегией, птозом и ретинопатией Низкорослость с миопатией и инсультоподобными эпизодами Экзокринная дисфункция поджелудочной железы с сидеробластной анемией Задержка развития или потеря навыков и офтальмоплегия, офтальмопарез

Митохондриальные болезни? Частота митохондриальных энцефалопатий определяется примерно как 1: 11.000 Общая частота митохондриальных заболеваний – как 1: 8.000 Возраст манифестациимитохондриальных заболеваний сильно варьирует ~ 50 % после 5 лет ~ 50% - до 5 лет Смертность от митохондриальных заболеваний составляет 5-20% в год от даты манифестации

Митохондриопатия, то после перенесенных инфекционных заболеваний его состояние может резко ухудшиться также отягощают состояние стресс, голодание, переохлаждение, продолжительная обездвиженность, прием седативных средств Осторожно применять местную и общую анестезию!

Болезней –насколько это реально? Фармакологический подход Витамины, кофакторы, «ловцы» свободных радикалов – для предотвращения повреждения дыхательной цепи Наиболее успешный пример – дихлорацетат, применяемый для уменьшения лактоацидоза у пациентов с МELAS Успех частичный и временный, чаще терапия неэффективна

Болезней (2) Другой подход - уменьшить соотношение мутантная:нормальная мтДНК I. Увеличить количество немутантных молекулпутем «сдвига генов» Обычно сателлитные клетки пролиферируют и сливаются со скелетными миофибриллами в ответ на стресс или упражнение У некоторых больных с миопатией % мутантной мтДНК в сателлитных клетках ниже, чем в в скелетной мышце Пропорция нормальных мтДНК молекул в мышце увеличивалась, дефект корректировался Индуцируется пролиферация сателлитных клеток в скелетных мышцах

Болезней (3) II.Уменьшить количество мутантных молекул мтДНК Разработка синтетических молекул, избирательно связывающихся с мутаными ДНК и блокирующих их репликацию Введение в митохондрии фермента рестриктазы, избирательно разрушающего мутантную ДНК Успех достигнут пока только in vitro

Болезней (4) «Молекулярно-внутриклеточная реконструкция» Импорт из цитоплазмы нормальных тРНК вместо дефектных митохондриальных Замена дефектного комплекса дых. цепи на нормальный, полученный из другого организма (дрожжей) Пересадка ядра яйцеклетки из мутантной цитоплазмы в нормальную Все эти подходы - в стадии экпериментальной разработки

Болезней –насколько это реально? Вылечить от митохондриального заболевания сегодня невозможно Применяется симптоматическое лечение: Физическое Физиотерапия, аэробная гимнастика, умеренные и легкие нагрузки Анти-эпилептические препараты, гормоны, витамины, метаболиты, кофакторы Фармакологическое Блефаропластика, имплантация cohlear, трансплантация сердца, почек, печени, подкожная эндоскопическая гастротомия, cricopharyngeal миотомия Хирургическое

Митохондриальные заболевания или отягощает их течение Вальпроат: увеличивает частоту судорог при MELAS, гепатотоксичен Аспирин, фенобарбитал Кортикостероиды Тетрациклин, хлорамфеникол Аминогликозидыстрептомицин, гентамицин, амикацин, неомицин, канамицин - ототоксичны Этамбутол (провоцирует проявление LHON) Статин (провоцирует проявление MELAS) Антиретровирусные препараты: AZT – zidovudine, doxorubicin вызывают деплецию мтДНК Список далеко не полный!

Сюрпризы митохондриального генома

Г.М. Дымшиц

Григорий Моисеевич Дымшиц, доктор биологических наук, профессор кафедры молекулярной биологии Новосибирского государственного университета, заведующий лабораторией структуры генома Института цитологии и генетики Сибирского отделения РАН. Соавтор и редактор четырех школьных учебников по общей биологии.

Со времени обнаружения в митохондриях молекул ДНК прошло четверть века, прежде чем ими заинтересовались не только молекулярные биологи и цитологи, но и генетики, эволюционисты, а также палеонтологи и криминалисты, историки и лингвисты. Такой широкий интерес спровоцировала работа А.Уилсона из Калифорнийского университета. В 1987 г. он опубликовал результаты сравнительного анализа ДНК митохондрий, взятых у 147 представителей разных этносов всех человеческих рас, заселяющих пять континентов. По типу, местоположению и количеству индивидуальных мутаций установили, что все митохондриальные ДНК возникли из одной предковой последовательности нуклеотидов путем дивергенции. В околонаучной прессе вывод этот интерпретировали крайне упрощенно - все человечество произошло от одной женщины, названной митохондриальной Евой (и дочери и сыновья получают митохондрии только от матери), которая жила в Северо-Восточной Африке около 200 тыс. лет назад. Еще через 10 лет удалось расшифровать фрагмент ДНК митохондрий, выделенный из останков неандертальца, и оценить время существования последнего общего предка человека и неандертальца в 500 тыс. лет назад .

Сегодня митохондриальная генетика человека интенсивно развивается как в популяционном, так и в медицинском аспекте. Установлена связь между рядом тяжелых наследственных заболеваний и дефектами в митохондриальных ДНК. Генетические изменения, ассоциированные со старением организма, наиболее выражены в митохондриях. Что же представляет из себя геном митохондрий, отличающийся у человека и других животных от такового у растений, грибов и простейших и по размеру, и по форме, и по генетической емкости? Как работает и как возник митохондриальный геном у разных таксонов? Об этом и пойдет речь в нашей статье.

Митохондрии называют энергетическими станциями клетки. Помимо наружной гладкой мембраны они имеют внутреннюю мембрану, образующую многочисленные складки - кристы. В них встроены белковые компоненты дыхательной цепи - ферменты, участвующие в преобразовании энергии химических связей окисляемых питательных веществ в энергию молекул аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ). Такой “конвертируемой валютой” клетка оплачивает все свои энергетические потребности. В клетках зеленых растений помимо митохондрий есть еще и другие энергетические станции - хлоропласты. Они работают на “солнечных батареях”, но тоже образуют АТФ из АДФ и фосфата. Как и митохондрии, хлоропласты - автономно размножающиеся органеллы - также имеют две мембраны и содержат ДНК.

В матриксе митохондрий, кроме ДНК, находятся и собственные рибосомы, по многим характеристикам отличающиеся от эвкариотических рибосом, расположенных на мембранах эндоплазматической сети. Однако на рибосомах митохондрий образуется не более 5% от всех белков, входящих в их состав. БOльшая часть белков, составляющих структурные и функциональные компоненты митохондрий, кодируется ядерным геномом, синтезируется на рибосомах эндоплазматической сети и транспортируется по ее каналам к месту сборки. Таким образом, митохондрии - это результат объединенных усилий двух геномов и двух аппаратов транскрипции и трансляции. Некоторые субъединичные ферменты дыхательной цепи митохондрий состоят из разных полипептидов, часть которых кодируется ядерным, а часть - митохондриальным геномом. Например, ключевой фермент окислительного фосфорилирования - цитохром-с-оксидаза у дрожжей состоит из трех субъединиц, кодируемых и синтезируемых в митохондриях, и четырех, кодируемых в ядре клетки и синтезируемых в цитоплазме. Экспрессией большинства генов митохондрий управляют определенные гены ядер.

Размеры и формы митохондриальных геномов

К настоящему времени прочитано более 100 разных геномов митохондрий. Набор и количество их генов в митохондриальных ДНК, для которых полностью определена последовательность нуклеотидов, сильно различаются у разных видов животных, растений, грибов и простейших. Наибольшее количество генов обнаружено в митохондриальном геноме жгутикового простейшего Rectinomonas americana - 97 генов, включая все кодирующие белок гены, найденные в мтДНК других организмов. У большинства высших животных геном митохондрий содержит 37 генов: 13 для белков дыхательной цепи, 22 для тРНК и два для рРНК (для большой субъединицы рибосом 16S рРНК и для малой 12S рРНК). У растений и простейших, в отличие от животных и большинства грибов, в митохондриальном геноме закодированы и некоторые белки, входящие в состав рибосом этих органелл. Ключевые ферменты матричного полинуклеотидного синтеза, такие как ДНК-полимераза (осуществляющая репликацию митохондриальной ДНК) и РНК-полимераза (транскрибирующая геном митохондрий), зашифрованы в ядре и синтезируются на рибосомах цитоплазмы. Этот факт указывает на относительность автономии митохондрий в сложной иерархии эвкариотической клетки.

Геномы митохондрий разных видов отличаются не только по набору генов, порядку их расположения и экспрессии, но по размеру и форме ДНК. Подавляющее большинство описанных сегодня митохондриальных геномов представляет собой кольцевые суперспирализованные двуцепочечные молекулы ДНК. У некоторых растений наряду с кольцевыми формами имеются и линейные, а у некоторых простейших, например инфузорий, в митохондриях обнаружены только линейные ДНК .

Как правило, в каждой митохондрии содержится несколько копий ее генома. Так, в клетках печени человека около 2 тыс. митохондрий, и в каждой из них - по 10 одинаковых геномов. В фибробластах мыши 500 митохондрий, содержащих по два генома, а в клетках дрожжей S.cerevisiae - до 22 митохондрий, имеющих по четыре генома.

Митохондриальный геном растений, как правило, состоит из нескольких молекул разного размера. Одна из них, “основная хромосома”, содержит большую часть генов, а кольцевые формы меньшей длины, находящиеся в динамическом равновесии как между собой, так и с основной хромосомой, образуются в результате внутри- и межмолекулярной рекомбинации благодаря наличию повторенных последовательностей (рис.1).

Рис 1. Схема образования кольцевых молекул ДНК разного размера в митохондриях растений.
Рекомбинация происходит по повторенным участкам (обозначены синим цветом).

Рис 2. Схема образования линейных (А), кольцевых (Б), цепных (В) олигомеров мтДНК.
ori - район начала репликации ДНК.

Размер генома митохондрий разных организмов колеблется от менее 6 тыс. пар нуклеотидов у малярийного плазмодия (в нем, помимо двух генов рРНК, содержится только три гена, кодирующих белки) до сотен тысяч пар нуклеотидов у наземных растений (например, у Arabidopsis thaliana из семейства крестоцветных 366924 пар нуклеотидов). При этом 7-8-кратные различия в размерах мтДНК высших растений обнаруживаются даже в пределах одного семейства. Длина мтДНК позвоночных животных отличается незначительно: у человека - 16569 пар нуклеотидов, у свиньи - 16350, у дельфина - 16330, у шпорцевой лягушки Xenopus laevis - 17533, у карпа - 16400. Эти геномы сходны также и по локализации генов, большинство которых располагаются встык; в ряде случаев они даже перекрываются, обычно на один нуклеотид, так что последний нуклеотид одного гена оказывается первым в следующем. В отличие от позвоночных, у растений, грибов и простейших мтДНК содержат до 80% некодирующих последовательностей. У разных видов порядок генов в геномах митохондрий отличается.

Высокая концентрация активных форм кислорода в митохондриях и слабая система репарации увеличивают частоту мутаций мтДНК по сравнению с ядерной на порядок. Радикалы кислорода служат причиной специфических замен Ц® Т (дезаминирование цитозина) и Г® Т (окислительное повреждение гуанина), вследствие чего, возможно, мтДНК богаты АТ-парами. Кроме того, все мтДНК обладают интересным свойством - они не метилируются, в отличие от ядерных и прокариотических ДНК. Известно, что метилирование (временная химическая модификация нуклеотидной последовательности без нарушения кодирующей функции ДНК) - один из механизмов программируемой инактивации генов .

Репликация и транскрипция ДНК митохондрий млекопитающих

У большинства животных комплементарные цепи в мтДНК значительно различаются по удельной плотности, поскольку содержат неодинаковое количество “тяжелых” пуриновых и “легких” пиримидиновых нуклеотидов. Так они и называются - H (heavy - тяжелая) и L (light - легкая) цепь. В начале репликации молекулы мтДНК образуется так называемая D-петля (от англ. displacement loop - петля смещения). Эта структура, видимая в электронный микроскоп, состоит из двуцепочечного и одноцепочечного (отодвинутой части Н-цепи) участков. Двуцепочечный участок формируется частью L-цепи и комплементарным ей вновь синтезированным фрагментом ДНК длиной 450-650 (в зависимости от вида организма) нуклеотидов, имеющим на 5"-конце рибонуклеотидную затравку, которая соответствует точке начала синтеза Н-цепи (ori H). Синтез L-цепи начинается лишь тогда, когда дочерняя Н-цепь доходит до точки ori L. Это обусловлено тем, что область инициации репликации L-цепи доступна для ферментов синтеза ДНК лишь в одноцепочечном состоянии, а следовательно, только в расплетенной двойной спирали при синтезе Н-цепи. Таким образом, дочерние цепи мтДНК синтезируются непрерывно и асинхронно (рис.3).

Рис 3. Схема репликации мтДНК млекопитающих.
Сначала формируется D-петля, затем синтезируется дочерняя Н-цепь,
потом начинается синтез дочерней L-цепи.

В митохондриях общее число молекул с D-петлей значительно превышает число полностью реплицирующихся молекул. Обусловлено это тем, что у D-петли есть дополнительные функции - прикрепление мтДНК к внутренней мембране и инициация транскрипции, поскольку в этом районе локализованы промоторы транскрипции обеих цепей ДНК.

В отличие от большинства эвкариотических генов, которые транскрибируются независимо друг от друга, каждая из цепей мтДНК млекопитающих переписывается с образованием одной молекулы РНК, начинающейся в районе ori H. Помимо этих двух длинных молекул РНК, комплементарных Н- и L-цепям, формируются и более короткие участки Н-цепи, которые начинаются в той же точке и заканчиваются на 3"-конце гена 16S рРНК (рис.4). Таких коротких транскриптов в 10 раз больше, чем длинных. В результате созревания (процессинга) из них образуются 12S рРНК и 16S рРНК, участвующие в формировании митохондриальных рибосом, а также фенилаланиновая и валиновая тРНК. Из длинных транскриптов вырезаются остальные тРНК и образуются транслируемые мРНК, к 3"-концам которых присоединяются полиадениловые последовательности. 5"-концы этих мРНК не кэпируются, что необычно для эвкариот. Сплайсинга (сращивания) не происходит, поскольку ни один из митохондриальных генов млекопитающих не содержит интронов.

Рис 4. Транскрипция мтДНК человека, содержащей 37 генов. Все транскрипты начинают синтезироваться в районе ori H. Рибосомные РНК вырезаются из длинного и короткого транскриптов Н-цепи. тРНК и мРНК образуются в результате процессинга из транскриптов обеих цепей ДНК. Гены тРНК обозначены светло-зеленым цветом.

Сюрпризы митохондриального генома

Несмотря на то, что в геномах митохондрий млекопитающих и дрожжей содержится приблизительно одинаковое количество генов, размеры дрожжевого генома в 4-5 раз больше - около 80 тыс. пар нуклеотидов. Хотя кодирующие последовательности мтДНК дрожжей высоко гомологичны соответствующим последовательностям у человека, дрожжевые мРНК дополнительно имеют 5"-лидерную и 3"-некодирующую области, как и большинство ядерных мРНК. Ряд генов содержит еще и интроны. Так, в гене box, кодирующем цитохромоксидазу b, имеется два интрона. Из первичного РНК-транскрипта автокаталитически (без участия каких-либо белков) вырезается копия большей части первого интрона. Оставшаяся РНК служит матрицей для образования фермента матуразы, участвующей в сплайсинге. Часть ее аминокислотной последовательности закодирована в оставшихся копиях интронов. Матураза вырезает их, разрушая свою собственную мРНК, копии экзонов сшиваются, и образуется мРНК для цитохромоксидазы b (рис.5). Открытие такого феномена заставило пересмотреть представление об интронах, как о “ничего не кодирующих последовательностях”.

Рис 5. Процессинг (созревание) мРНК цитохромоксидазы b в митохондриях дрожжей.
На первом этапе сплайсинга образуется мРНК, по которой синтезируется матураза,
необходимая для второго этапа сплайсинга.

При изучении экспрессии митохондриальных генов Trypanosoma brucei обнаружилось удивительное отклонение от одной из основных аксиом молекулярной биологии, гласящей, что последовательность нуклеотидов в мРНК в точности соответствует таковой в кодирующих участках ДНК. Оказалось, мРНК одной из субъединиц цитохром-с-оксидазы редактируется, т.е. после транскрипции изменяется ее первичная структура - вставляется четыре урацила. В результате образуется новая мРНК, служащая матрицей для синтеза дополнительной субъединицы фермента, последовательность аминокислот в которой не имеет ничего общего с последовательностью, кодируемой нередактированной мРНК (см. таблицу).

Впервые обнаруженное в митохондриях трипаносомы редактирование РНК широко распространено в хлоропластах и митохондриях высших растений. Найдено оно и в соматических клетках млекопитающих, например, в кишечном эпителии человека редактируется мРНК гена аполипопротеина.

Наибольший сюрприз ученым митохондрии преподнесли в 1979 г. До того времени считалось, что генетический код универсален и одни и те же триплеты кодируют одинаковые аминокислоты у бактерий, вирусов, грибов, растений и животных. Английский исследователь Беррел сопоставил структуру одного из митохондриальных генов теленка с последовательностью аминокислот в кодируемой этим геном субъединице цитохромоксидазы. Оказалось, что генетический код митохондрий крупного рогатого скота (как и человека) не просто отличается от универсального, он “идеален”, т.е. подчиняется следующему правилу: “если два кодона имеют два одинаковых нуклеотида, а третьи нуклеотиды принадлежат к одному классу (пуриновых - А, Г, или пиримидиновых - У, Ц), то они кодируют одну и ту же аминокислоту”. В универсальном коде есть два исключения из этого правила: триплет АУА кодирует изолейцин, а кодон АУГ - метионин, в то время как в идеальном коде митохондрий оба эти триплета кодируют метионин; триплет УГГ кодирует лишь триптофан, а триплет УГА - стоп-кодон. В универсальном коде оба отклонения касаются принципиальных моментов синтеза белка: кодон АУГ - инициирующий, а стоп-кодон УГА останавливает синтез полипептида. Идеальный код присущ не всем описанным митохондриям, но ни у одной из них нет универсального кода. Можно сказать, что митохондрии говорят на разных языках, но никогда - на языке ядра.

Как уже говорилось, в митохондриальном геноме позвоночных есть 22 гена тРНК. Каким же образом такой неполный набор обслуживает все 60 кодонов для аминокислот (в идеальном коде из 64 триплетов четыре стоп-кодона, в универсальном - три)? Дело в том, что при синтезе белка в митохондриях упрощены кодон-антикодонные взаимодействия - для узнавания используется два из трех нуклеотидов антикодона. Таким образом, одна тРНК узнает все четыре представителя кодонового семейства, отличающиеся только третьим нуклеотидом. Например, лейциновая тРНК с антикодоном ГАУ встает на рибосоме напротив кодонов ЦУУ, ЦУЦ, ЦУА и ЦУГ, обеспечивая безошибочное включение лейцина в полипептидную цепь. Два других лейциновых кодона УУА и УУГ узнаются тРНК с антикодоном ААУ. В целом, восемь разных молекул тРНК узнают восемь семейств по четыре кодона в каждом, и 14 тРНК узнают разные пары кодонов, каждая из которых шифрует одну аминокислоту.

Важно, что ферменты аминоацил-тРНК-синтетазы, ответственные за присоединение аминокислот к соответствующим тРНК митохондрий, кодируются в ядре клетки и синтезируются на рибосомах эндоплазматической сети. Таким образом, у позвоночных животных все белковые компоненты митохондриального синтеза полипептидов зашифрованы в ядре. При этом синтез белков в митохондриях не подавляется циклогексимидом, блокирующим работу эвкариотических рибосом, но чувствителен к антибиотикам эритромицину и хлорамфениколу, ингибирующим белковый синтез в бактериях. Этот факт служит одним из аргументов в пользу происхождения митохондрий из аэробных бактерий при симбиотическом образовании эвкариотических клеток .

Симбиотическая теория происхождения митохондрий

Гипотезу о происхождении митохондрий и растительных пластид из внутриклеточных бактерий-эндосимбионтов высказал Р.Альтман еще в 1890 г. За век бурного развития биохимии, цитологии, генетики и появившейся полвека назад молекулярной биологии гипотеза переросла в теорию, основанную на большом фактическом материале. Суть ее такова: с появлением фотосинтезирующих бактерий в атмосфере Земли накапливался кислород - побочный продукт их метаболизма. С ростом его концентрации усложнялась жизнь анаэробных гетеротрофов, и часть из них для получения энергии перешла от бескислородного брожения к окислительному фосфорилированию. Такие аэробные гетеротрофы могли с бOльшим КПД, чем анаэробные бактерии, расщеплять органические вещества, образующиеся в результате фотосинтеза. Часть свободно живущих аэробов была захвачена анаэробами, но не “переварена”, а сохранена в качестве энергетических станций, митохондрий. Не стоит рассматривать митохондрии как рабов, взятых в плен, чтобы снабжать молекулами АТФ не способные к дыханию клетки. Они скорее “существа”, еще в протерозое нашедшие для себя и своего потомства лучшее из убежищ, где можно затрачивать наименьшие усилия, не подвергаясь риску быть съеденными.

В пользу симбиотической теории говорят многочисленные факты:

- совпадают размеры и формы митохондрий и свободно живущих аэробных бактерий; те и другие содержат кольцевые молекулы ДНК, не связанные с гистонами (в отличие от линейных ядерных ДНК);
По нуклеотидным последовательностям рибосомные и транспортные РНК митохондрий отличаются от ядерных, демонстрируя при этом удивительное сходство с аналогичными молекулами некоторых аэробных грамотрицательных эубактерий;
Митохондриальные РНК-полимеразы, хотя и кодируются в ядре клетки, ингибируются рифампицином, как и бактериальные, а эвкариотические РНК-полимеразы нечувствительны к этому антибиотику;
Белковый синтез в митохондриях и бактериях подавляется одними и теми же антибиотиками, не влияющими на рибосомы эвкариот;
Липидный состав внутренней мембраны митохондрий и бактериальной плазмалеммы сходен, но сильно отличается от такового наружной мембраны митохондрий, гомологичной другим мембранам эвкариотических клеток;
Кристы, образуемые внутренней митохондриальной мембраной, являются эволюционными аналогами мезосомных мембран многих прокариот;
До сих пор сохранились организмы, имитирующие промежуточные формы на пути к образованию митохондрий из бактерий (примитивная амеба Pelomyxa не имеет митохондрий, но всегда содержит эндосимбиотические бактерии).

Существует представление, что разные царства эвкариот имели разных предков и эндосимбиоз бактерий возникал на разных этапах эволюции живых организмов. Об этом же говорят отличия в строении митохондриальных геномов простейших, грибов, растений и высших животных. Но во всех случаях основная часть генов из промитохондрий попала в ядро, возможно, с помощью мобильных генетических элементов. При включении части генома одного из симбионтов в геном другого интеграция симбионтов становится необратимой.

Новый геном может создавать метаболические пути, приводящие к образованию полезных продуктов, которые не могут быть синтезированы ни одним из партнеров по отдельности. Так, синтез стероидных гормонов клетками коры надпочечников представляет собой сложную цепь реакций, часть которых происходит в митохондриях, а часть - в эндоплазматической сети . Захватив гены промитохондрий, ядро получило возможность надежно контролировать функции симбионта. В ядре кодируются все белки и синтез липидов наружной мембраны митохондрий, большинство белков матрикса и внутренней мембраны органелл. Самое главное, что ядро кодирует ферменты репликации, транскрипции и трансляции мтДНК, контролируя тем самым рост и размножение митохондрий. Скорость роста партнеров по симбиозу должна быть приблизительно одинаковой. Если хозяин будет расти быстрее, то с каждым его поколением число симбионтов, приходящихся на одну особь, будет уменьшаться, и, в конце концов, появятся потомки, не имеющие митохондрий. Мы знаем, что в каждой клетке организма, размножающегося половым путем, содержится много митохондрий, реплицирующих свои ДНК в промежутке между делениями хозяина. Это служит гарантией того, что каждая из дочерних клеток получит по крайней мере одну копию генома митохондрии.

Цитоплазматическая наследственность

Помимо кодирования ключевых компонентов дыхательной цепи и собственного белоксинтезирующего аппарата, митохондриальный геном в отдельных случаях участвует в формировании некоторых морфологических и физиологических признаков. К таким признакам относятся характерные для ряда видов высших растений синдром NCS (non-chromosomal stripe, нехромосомно кодируемая пятнистость листьев) и цитоплазматическая мужская стерильность (ЦМС), приводящая к нарушению нормального развития пыльцы. Проявление обоих признаков обусловлено изменениями в структуре мтДНК. При ЦМС наблюдаются перестройки геномов митохондрий в результате рекомбинационных событий, ведущих к делециям, дупликациям, инверсиям или инсерциям определенных нуклеотидных последовательностей или целых генов. Такие изменения могут вызывать не только повреждения имеющихся генов, но и появление новых работающих генов.

Цитоплазматическая наследственность, в отличие от ядерной, не подчиняется законам Менделя. Это связано с тем, что у высших животных и растений гаметы от разных полов содержат несопоставимые количества митохондрий. Так, в яйцеклетке мыши имеется 90 тыс. митохондрий, а в сперматозоиде - лишь четыре. Очевидно, что в оплодотворенной яйцеклетке митохондрии преимущественно или только от женской особи, т.е. наследование всех митохондриальных генов материнское. Генетический анализ цитоплазматической наследственности затруднен из-за ядерно-цитоплазматических взаимодействий. В случае цитоплазматической мужской стерильности мутантный митохондриальный геном взаимодействует с определенными генами ядра, рецессивные аллели которых необходимы для развития признака. Доминантные аллели этих генов как в гомо-, так и в гетерозиготном состоянии восстанавливают фертильность растений вне зависимости от состояния митохондриального генома.

Изучение геномов митохондрий, их эволюции, идущей по специфическим законам популяционной генетики, взаимоотношений между ядерными и митохондриальными генетическими системами, необходимо для понимания сложной иерархической организации эвкариотической клетки и организма в целом.

С определенными мутациями в митохондриальной ДНК или в ядерных генах, контролирующих работу митохондрий, связывают некоторые наследственные болезни и старение человека . Накапливаются данные об участии дефектов мтДНК в канцерогенезе. Следовательно, митохондрии могут быть мишенью химиотерапии рака. Имеются факты о тесном взаимодействии ядерного и митохондриального геномов в развитии ряда патологий человека. Множественные делеции мтДНК обнаружены у больных с тяжелой мышечной слабостью, атаксией, глухотой, умственной отсталостью, наследующихся по аутосомно-доминантному типу. Установлен половой диморфизм в клинических проявлениях ишемической болезни сердца, что скорее всего обусловлено материнским эффектом - цитоплазматической наследственностью. Развитие генной терапии внушает надежду на исправление дефектов в геномах митохондрий в обозримом будущем.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований. Проект 01-04-48971.
Автор признателен аспиранту М.К.Иванову, создавшему рисунки к статье.

Литература

1. Янковский Н.К., Боринская С.А. Наша история, записанная в ДНК // Природа. 2001. №6. С.10-18.

2. Минченко А.Г., Дударева Н.А. Митохондриальный геном. Новосибирск, 1990.

3. Гвоздев В.А. // Сорос. образоват. журн. 1999. №10. С.11-17.

4. Маргелис Л. Роль симбиоза в эволюции клетки. М., 1983.

5. Скулачев В.П. // Сорос. образоват. журн. 1998. №8. С.2-7.

6. Игамбердиев А.У. // Сорос. образоват. журн. 2000. №1. С.32-36.

Геном митохондрий человека представлен кольцевой двухцелочечной молекулой ДНК, содержащей 16559 п.н. Доля митохондриальной ДНК от общего количества ДНК достигает 5%. Митохондриальная молекула ДНК состоит из тяжелой (Н) и легкой (L) - цепей. Цепи различаются по нуклеотидному составу. Н-цепь (heavy) содержит больше пурина, легкая L-цепь (ligbt) - больше пиримидина. Митохондриальный геном человека, как и других организмов, представляет собой полуавтономную генетическую систему. Большая часть генов человека локализована в хромосомах ядра, и меньшая - в митохондриальном геноме. 1987г-Адан Уилсон исследовал ДНК 147 представителей различных расс(женщин). Анализ показал, что все мтДНК можно представить как происходящие от одной предковой. Общаа праматерь, к которой восходят все типы мтДНК современных людей, жила в Восточной Африке менее 200тыс лет назад. Митохондрии - это внутриклеточные органеллы, имеющие небольшую собственную хромосому. В отличие от ядерной ДНК, которая содержит подавляющее большинство генов и в процессе полового размножения подвергается рекомбинации, так что потомки получают половину генов от отца, а вторую половину от матери, митохондрии и их ДНК ребёнок получает только из материнской яйцеклетки. Поскольку митохондриальная ДНК не подвергается рекомбинации, изменения в ней могут происходить исключительно посредством редких случайных мутаций. Митохондриа́льные заболева́ния - группа наследственных заболеваний, связанных с дефектами в функционировании митохондрий, приводящими к нарушениям энергетических функций в клетках эукариотов, в частности - человека. Митохондриальные заболевания обусловлены генетическими, структурными, биохимическими дефектами митохондрий, приводящими к нарушениям тканевого дыхания. Они передаются только по женской линии к детям обоих полов, так как сперматозоиды передают зиготе половину ядерного генома, а яйцеклетка поставляет и вторую половину генома, и митохондрии. Патологические нарушения клеточного энергетического обмена могут проявляться в виде дефектов различных звеньев в цикле Кребса, в дыхательной цепи, процессах бета-окисления и т. д. Эффекты митоходриальных заболеваний очень разнообразны. Из-за различного распределения дефектных митохондрий в разных органах, мутация у одного человека может привести к заболеванию печени, а у другого - к заболеванию мозга. Величина проявления дефекта может быть большой или малой, и она может существенно изменяться, медленно нарастая во времени. Некоторые небольшие дефекты приводят лишь к неспособности пациента выдерживать физическую нагрузку, соответствующую его возрасту, и не сопровождаются серьёзными болезненными проявлениями. Другие дефекты могут быть более опасны, приводя к серьёзной патологии.В общем случае, митоходриальные заболевания проявляются сильнее при локализации дефектных митохондрий в мышцах, мозге, нервной ткани, поскольку эти органы требуют больше всего энергии для выполнения соответствующих функций. Для постановки диагноза митохондриального заболевания важен комплексный генеалогический, клинический, биохимический, морфологический и генетический анализ

П.П.Гаряев

ЛИНГВИСТИКО-ВОЛНОВОЙ ГЕНОМ. ТЕОРИЯ И ПРАКТИКА.
(201 стр., 32 рисунка, 4 таблицы, 12 графиков, 36 фотографий)

Московский Государственный Технический Университет им. Н.Э.Баумана

Институт Квантовой Генетики

В книге д.б.н., акад. РАМТН и РАЕН П.П.Гаряева «Волновой геном. Теория и практика» затронуты фундаментальные вопросы генетического кода, которые связаны со структурой, функционированием. Понятно, что мы еще далеки от полного решения всех вопросов генетического кода, но идеи проф. Гаряева П.П. и его коллег дают возможность увидеть нечто совершенно новое в работе хромосомного аппарата живых клеток. Видится принципиально новое научно-практическое направление, которое можно было бы назвать «генетико-волновая навигация и управление в биосистемах». Оно подано автором в рамках теоретических моделей, подтверждаемых собственными и независимыми экспериментальными исследованиями. Квантовая составляющая генетической работы клеток представляется чрезвычайно важной. Ясно, что гигантским по масштабам и сложности метаболизмом клеток, тканей и организма в целом необходимо управлять. В связи с этим автор выдвигает новую и существенную идею генетического квантового биокомпьютинга. Такой подход интересен и для опторадиоэлектроники, радиотехники, компьютинга, систем навигации и управления. Более того, волновые механизмы работы клеток имеют прямое отношение к наноэлектронике. Живые организмы наглядно показывают нам примеры нанобиотехнологий, эффективно используя для собственной волновой биокомпьютерной регуляции такие активно работающие наноструктуры как ферменты, рибосомы, митохондрии, мембраны, цитоскелет и хромосомы. Нанотехнические механизмы работы клеток и их генетического аппарата нуждаются в теоретико-биологическом осмыслении и физико-математическом анализе, который позволяет создать, в том числе, неизвестные ранее принципиально новые лазерно-радиоволновые технологии генетического управления метаболизмом многоклеточных организмов. Результаты использования таких технологий коллективом П.П.Гаряева впечатляют. Авторами корректно и развернуто продемонстрирована дальняя (многокилометровая) волновая передача реальной управляющей генетической информации от Донора (живой ткани) к Реципиенту (организму). Такая передача до недавнего времени считалась принципиально невозможной. Теперь это фундаментальный факт. Появляется возможность создания совершенной уникальной молекулярно-оптико-радиоэлектронной аппаратуры, которая сможет осуществлять сложнейшие навигационно-регуляторные функции для позитивного управления генетико-физиологическими функциями организмов. Рассматривается проблема по созданию генетического лазера. Факт лазерной накачки ДНК и хромосом ‘in vitro’ акад. П.П.Гаряевым и его коллегами уже продемонстрирован и опубликован в 1996 г. и подтвержден работами японских исследователей в 2002 г. Такой лазер будет выполнять многие, ранее непонятные функции генетического аппарата для решения проблем биологии, медицины и сельского хозяйства. Другая сторона такой работы – это возможность применения когерентных состояний и излучений живых клеток и их информационных структур для проектирования биокомпьютеров, работающих на принципах голографии, солитоники и квантовой нелокальности. Фактически прообраз такого биокомпьютера создан коллективом П. Гаряева, что и позволило получить уникальные результаты по квантовой трансляции генов и дальнему волновому генетическому управлению. Использование хромосомных лазеров и биокомпьютеров не ограничивается сказанным и распространяется шире за пределы биосистем – на космическую связь, управление сверхсложными техническим процессами, авиационную навигацию и т.д. В работе выделяется ряд нерешенных задач, в том числе исследование волновых реплик ДНК и лазерно-радиоволновых процессов, имеющими место при снятии и передаче квантовой биоинформации от Донора к Реципиенту. Считаю, что выход в свет монографии П.П. Гаряева будет способствовать дальнейшему процессу дознания одной из божественных загадок – загадок генетического кода и приведет к применению новых идей на благо человечества.

В.А. Матвеев
Доктор технических наук,
Профессор МГТУ им. Н.Э. Баумана,
Декан факультета «Информатика и системы управления»,
Заслуженный деятель науки РФ,
Лауреат премий Правительства РФ и города Москвы

Скачать книгу можно тут.

Возможно, будет полезно почитать: